|
|
Strukturně-funkční aspekty adenylát cyklázového toxinu z bakterie Bordetella pertussis
Březinová, Karolína ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Brzobohatá, Hana (oponent)
Černý kašel (pertuse) je vysoce infekční onemocnění dýchacích cest, které je způsobeno Gram negativní bakterií Bordetella pertussis. I přesto, že je ve vyspělých zemích proočkovanost populace vysoká, tak pertuse patří mezi nejrozšířenější onemocnění, před kterým se lze bránit očkováním. Bakterie produkuje celou řadu faktorů virulence, které usnadňují proces kolonizace řasinkového epitelu a infekci horních cest dýchacích. Mezi nejdůležitější faktory virulence patří adenylát cyklázový toxin (CyaA). Tento toxin se řadí mezi tzv. RTX (Repeat-In-ToXins) proteiny, které jsou uvolňovány z bakterie pomocí sekrečního aparátu typu 1 (T1SS). CyaA je multifunkční toxin, vykazující jak hemolytickou, tak i cytotoxickou aktivitu. Cytotoxická aktivita toxinu je způsobena N-koncovou adenylyl cyklázovou (AC) doménou, která je napřímo dopravována přes cytoplasmatickou membránu do cytosolu buněk, kde interaguje s kalmodulinem a katalyzuje nekontrolovatelnou přeměnu adenosintrifosfátu (ATP) na cyklický adenosin-3',5'-monofosát (cAMP). Receptorem CyaA toxinu na povrchu buněk je integrinový receptor CD11b/CD18 (známý též jako komplementový receptor typu 3), který se primárně vyskytuje na fagocytujících buňkách hostitelského organismu. Tato práce se zaměřuje na strukturně-funkční aspekty toxinu CyaA a shrnuje poznatky o...
|
|
|
Studium interakcí proteinkinasy CaMKK2 s kalmodulinem pomoci fluorescenční spektroskopie.
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasy jsou členy významné CaMK rodiny, která se účastní CaMK kaskády. Jedním z nich je Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkina- sakinasa 2 (CaMKK2), která je aktivována vazbou komplexu Ca2+ /CaM. CaMKK2 se od většiny ostatních proteinkinas liší zejména strukturou v blízkosti αE-helixu a auto- inhibiční domény. Protože se autoinhibiční doména překrývá s Ca2+ /CaM-vazebnou doménou, lze před- pokládat, že vazba kalmodulinu způsobuje strukturní změny v oblastech interagujících s autoinhibiční doménou a ovlivňuje přístupnost těchto oblastí pro jiné molekuly. Pro ověření tohoto předpokladu byl exprimován a vypurifikován mutant CaMKK2 W445F, v jehož sekvenci se nachází pouze jeden tryptofanový zbytek na pozici 374, který se nachází v blízkosti sledované oblasti helixu αE. Strukturní změny v této oblasti byly pozorovány prostřednictvím zhášení intenzity fluorescence tryptofanového zbytku Trp374 prostřednictvím akrylamidu.Tato měření mohou poskytnout informaci o přístupnosti sle- dované oblasti. Porovnání zhášení fluorescence v přítomnosti a nepřítomnosti kalmodu- linu naznačilo, že při interakci CaMKK2 s kalmodulinem dochází ve sledované oblasti v blízkosti Trp374 ke...
|
|
|
Studium struktury komplexů proteinu 14-3-3 s CaMKK1 a CaMKK1:Ca2+/CaM
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ -signální dráha je jedním z nejvýznamnějších mechanismů přenosu informace v buňce. Rodina Ca2+ /kalmodulin-dependentních proteinkinas (CaMKs) je skupina se- rin/threonin kinas, jejichž aktivita je regulována intracelulární koncentrací iontů Ca2+ a vazbou receptorového proteinu iontů Ca2+ kalmodulinu (CaM). Součástí této pro- teinové rodiny je tzv. Ca2+ /CaM-dependentní kaskáda, jejímž členem je Ca2+ /CaM- dependentní proteinkinasa kinasa (CaMKK), která se u savců nachází ve dvou iso- formách, CaMKK1 a CaMKK2. Aktivita CaMKK1 je regulována nejen vazbou kalmodulinu, ale i fosforylací cAMP- dependentní proteinkinasou A, která zároveň ve struktuře CaMKK1 vytváří vazebné motivy rozpoznávané regulačními proteiny 14-3-3. Dřívější studie interakce CaMKK1 s proteiny 14-3-3 naznačily, že tato interakce nejen udržuje neaktivní CaMKK1 v inhi- bovaném stavu, ale také znepřístupňuje její aktivní místo a přímo inhibuje aktivitu CaMKK1. Struktura proteinového komplexu, který vzniká mezi CaMKK1 a 14-3-3 proteinem je však stále neznámá. Hlavním cílem této práce bylo charakterizovat proteinové komplexy vznikající in- terakcemi mezi CaMKK1, kalmodulinem a proteinem 14-3-3γ, a to pomocí metod ana- lytické ultracentrifugace,...
|
|
|
Strukturní charakterizace lidské proteinkinasy CaMKK2 a jejích interakcí s vazebnými partnery
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2) patří do rodiny serin/threonin proteinkinas, které se účastní vápníkové signální dráhy. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci kalmodulinu (CaM), který následně aktivuje své vazebné partnery, mezi které patří CaMKII, CaMKIII, CaMKK1 a CaMKK2. CaMKK2 následně aktivuje prostřednictvím fosforylace proteinkinasy CaMKI, CaMKIV a AMP-dependentní kinasu, AMPK. Přirozeně se v buňkách CaMKK2 vyskytuje v autoinhibovaném stavu, který je způsobený sterickým bráněním aktivního místa autoinhibiční doménou. Při vazbě s kalmodulinem dochází k odklonění autoinhibiční domény a tím ke zpřístupnění aktivního místa. Po aktivaci dochází u CaMKK k autofosforylaci a tím ke zvýšení aktivity. Negativní regulace je způsobena fosforylací cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA) a GSK3. Pro CaMKK1 i CaMKK2 byla identifikována místa, která jsou fosforylována PKA. Dvě z nich jsou součástí vazebného motivu pro proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK2 v inhibovaném stavu tím, že brání defosforylaci S495, který blokuje vytvoření vazby s kalmodulinem. Nicméně je nejasné, jestli je to jediná úloha proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2. Hlavním cílem této diplomové práce byla optimalizace...
|
|
|
Studium struktury komplexů proteinu 14-3-3 s CaMKK1 a CaMKK1:Ca2+/CaM
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ -signální dráha je jedním z nejvýznamnějších mechanismů přenosu informace v buňce. Rodina Ca2+ /kalmodulin-dependentních proteinkinas (CaMKs) je skupina se- rin/threonin kinas, jejichž aktivita je regulována intracelulární koncentrací iontů Ca2+ a vazbou receptorového proteinu iontů Ca2+ kalmodulinu (CaM). Součástí této pro- teinové rodiny je tzv. Ca2+ /CaM-dependentní kaskáda, jejímž členem je Ca2+ /CaM- dependentní proteinkinasa kinasa (CaMKK), která se u savců nachází ve dvou iso- formách, CaMKK1 a CaMKK2. Aktivita CaMKK1 je regulována nejen vazbou kalmodulinu, ale i fosforylací cAMP- dependentní proteinkinasou A, která zároveň ve struktuře CaMKK1 vytváří vazebné motivy rozpoznávané regulačními proteiny 14-3-3. Dřívější studie interakce CaMKK1 s proteiny 14-3-3 naznačily, že tato interakce nejen udržuje neaktivní CaMKK1 v inhi- bovaném stavu, ale také znepřístupňuje její aktivní místo a přímo inhibuje aktivitu CaMKK1. Struktura proteinového komplexu, který vzniká mezi CaMKK1 a 14-3-3 proteinem je však stále neznámá. Hlavním cílem této práce bylo charakterizovat proteinové komplexy vznikající in- terakcemi mezi CaMKK1, kalmodulinem a proteinem 14-3-3γ, a to pomocí metod ana- lytické ultracentrifugace,...
|
|
|
Studium interakcí proteinkinasy CaMKK2 s kalmodulinem pomoci fluorescenční spektroskopie.
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasy jsou členy významné CaMK rodiny, která se účastní CaMK kaskády. Jedním z nich je Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkina- sakinasa 2 (CaMKK2), která je aktivována vazbou komplexu Ca2+ /CaM. CaMKK2 se od většiny ostatních proteinkinas liší zejména strukturou v blízkosti αE-helixu a auto- inhibiční domény. Protože se autoinhibiční doména překrývá s Ca2+ /CaM-vazebnou doménou, lze před- pokládat, že vazba kalmodulinu způsobuje strukturní změny v oblastech interagujících s autoinhibiční doménou a ovlivňuje přístupnost těchto oblastí pro jiné molekuly. Pro ověření tohoto předpokladu byl exprimován a vypurifikován mutant CaMKK2 W445F, v jehož sekvenci se nachází pouze jeden tryptofanový zbytek na pozici 374, který se nachází v blízkosti sledované oblasti helixu αE. Strukturní změny v této oblasti byly pozorovány prostřednictvím zhášení intenzity fluorescence tryptofanového zbytku Trp374 prostřednictvím akrylamidu.Tato měření mohou poskytnout informaci o přístupnosti sle- dované oblasti. Porovnání zhášení fluorescence v přítomnosti a nepřítomnosti kalmodu- linu naznačilo, že při interakci CaMKK2 s kalmodulinem dochází ve sledované oblasti v blízkosti Trp374 ke...
|
|
|
Preparation and characterization of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2 (CaMKK2).
Jarosilová, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent)
Kalmodulinová proteinkinasová kaskáda je signální dráha, která se podílí na buněčné odpovědi na zvýšenou koncentraci vápenatých iontů uvnitř buňky. Ca2+ patří mezi sekundární posly, které zajišťují odpověď na mnoho podnětů. Většina těchto odpovědí začíná navázáním vápenatých iontů na kalmodulin, receptorový protein uvnitř buňky. Vazbou se zvyšuje afinita kalmodulinu k dalším proteinům, které jsou součástí signální kaskády. Jedním z interakčních partnerů kalmodulinu je kalcium/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2). CaMKK2 je serin/treoninová proteinkinasa, která se podílí zejména na regulaci genové exprese, dále také na regulaci energetické rovnováhy. CaMKK2 se skládá z několika funkčních oblastí, z nichž nejprozkoumanější je kinasová doména (její struktura již byla vyřešena díky krystalografickým studiím). Ta se nachází v prostřední části proteinu (přibližně 298 aminokyselinových zbytků) o velikosti 588 aminokyselin. U zbytku proteinu se předpokládá, že je převážně nestrukturovaný a částečně se strukturalizuje až po navázání ligandu. Cílem této práce bylo připravit několik expresních konstruktů lidské CaMKK2. Tyto konstrukty jsou určeny pro strukturní studie a dále také pro studium interakcí a aktivity jednotlivých proteinů. Při navrhování a přípravě expresních konstruktů se...
|
host ::
RSS.